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È stata fondata nel 1004 dal santo a cui è dedicata, cinquant'anni prima dello scisma fra la Chiesa cattolica ed ortodossa: tuttavia questo monastero è di rito bizantino, ed è alle dipendenze della Santa Sede. L'abate Nilo, nato nella Calabria bizantina e quindi greco di origine e di rito, fondatore di vari monasteri, decise di fondare un monastero sui colli di Tuscolo, sui ruderi di una grande villa romana, dove sembra gli sia apparsa la Madonna. Anche se l'abbazia non venne vista compiuta da Nilo, poiché questi morì a Tusculum l'anno successivo al suo arrivo nell'attuale zona di Grottaferrata. I lavori vennero terminati sotto il controllo di san Bartolomeo, co-fondatore dell'abbazia. Le reliquie di Bartolomeo si dovrebbero ancora trovare nell'abbazia, anche se non sono state ritrovate assieme a quelle di Nilo. I primi archimandriti dell'abbazia dopo san Nilo furono Paolo, Cirillo e san Bartolomeo il Giovane: sotto la loro guida l'abbazia si arricchì di decorazioni, di ricchezze e di possedimenti: in breve, da Grottaferrata dipesero ventidue chiese succursali sparse in tutta l'Italia centro-meridionale. Solo pochi anni dopo la sua fondazione, il monastero ospitava già circa 200 monaci basiliani, e le continue donazioni portarono l'archimandrita a controllare territori vastissimi in Lazio e nel Sud Italia: i feudi campani di Rofrano nella diocesi di Policastro e di Conca della Campania nella diocesi di Caserta, i castelli laziali di Castel de' Paolis nella diocesi suburbicaria di Albano e di Borghetto di Grottaferrata nella diocesi suburbicaria di Frascati, i casali calabresi di Cotrone, Ungolo e Baracala nell'arcidiocesi di Cosenza, le rettorìe di Diano attuale Teggiano e Saxano nella diocesi di Capaccio, le grangie di San Salvatore nella diocesi suburbicaria di Albano e di Colle Peschio nella diocesi suburbicaria di Velletri ed il monastero di Morbino nella diocesi di Venosa. L'abbazia inoltre ottenne da molti papi il riconoscimento della propria autonomia rispetto ai cardinali vescovi della diocesi suburbicaria di Frascati. Nel 2004 è ricorso il millenario della fondazione dell'abbazia di Santa Maria di Grottaferrata: per l'evento sono stati organizzati numerosi eventi, la Città del Vaticano ha emesso una cartolina postale speciale e Poste Italiane ha diffuso un francobollo ed un annullo speciale figurato dedicati a san Nilo da Rossano ed all'abbazia.
